УДК 616.360-008-092.9-02:613.2:613.863
М.А. Кузнецова
Харьковский национальный медицинский университет
ВЛИЯНИЕ гиперкалорийного рациона питания БЕРЕМЕННЫХ КРЫС НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ
Исследовано морфофункциональное состояние печени 7 подопытных крыс, получавших в течение беременности несбалансированное питание с избытком углеводов и жиров, и 6 крыс группы контроля. Морфологические изменения органа у крыс 2-й (опытной) группы заключались в дискомплексации балочно-радиарного строения, белковой дистрофии гепатоцитов, повышении регенераторной активности печени и повышении стромально-паренхиматозного индекса в ткани печени. Функциональные нарушения проявлялись развитием диспротеинемии, гиперлипидемии, гипергликемии, гиперкетонемии. Это свидетельствует о наличии риска развития у крыс фиброза печени, жирового гепатоза и СД 2-го типа.
Ключевые слова: морфофункциональное состояние печени, гиперкалорийная диета, беременные крысы.
Введение
Патология печени занимает одно из ведущих мест среди заболеваний органов пищеварения. По информации ВОЗ в мире более 2 млрд человек страдают заболеваниями печени, что в 100 раз превышает распространённость ВИЧ-инфекции. В Украине за последние 10 лет данный показатель увеличился на 20,1% [1]. Среди беременных заболевания печени являются одной из наиболее распространённых (3–5% от всех заболеваний) и значимых форм гестационной патологии [2]. Согласно статистическим данным, за последние годы в структуре поражений печени преобладают алкогольные и вирусные гепатиты и циррозы, увеличился процент опухолевой патологии печени, аутоиммунных заболеваний и поражение печени вследствие нарушений обмена веществ, в том числе ожирения [3, 4].
Достаточно много экспериментальных исследований посвящено изучению влияния ожирения, вызванного высокожировым рационом питания на организм небеременных самок крыс [5–7]. Были выявлены гипертрофия гепатоцитов, накопление в них жировых вакуолей и нарушение внутриклеточной архитектоники преимущественно в перипортальной зоне, угнетение макрофагальной системы печени (сниженное количество и функциональная активность клеток Купфера) [5, 6].
Установлена роль алиментарного фактора в развитии ожирения, липидных нарушений и инсулинорезистентности у беременных женщин [8]. Высококалорийное питание приводит к уменьшению количества митохондриальной ДНК в печени. Это было показано в эксперименте на грызунах [9]. Но, несмотря на наличие работ, посвященных изучению влияния экзогенных факторов на организм крыс, комплексное действие несбалансированного рациона питания с избытком жиров и углеводов на морфофункциональное состояние печени беременных самок крыс остаётся не до конца изученным.
Цель работы – изучение влияния нерационального питания с избытком углеводов и жиров на морфофункциональное состояние печени беременных крыс.
Материал и методы
Экспериментальное исследование проведено на 3-месячных рандомбредных крысах-самках популяции WAG/G Sto, которые были разделены на две группы: 7 самок, получавших в период беременности рациональное питание, составили 1-ю (контрольную) группу; 6 самок, которые на протяжении беременности получали нерациональное питание с избытком углеводов и жиров, включены во 2-ю группу (основную). Моделирование влияния алиментарного фактора на крыс осуществлялось с использованием экспериментальной модели, разработанной на кафедре патологической физиологии им. Д.Е. Альперна Харьковского национального медицинского университета [10].
Морфологическое исследование ткани печени проведено по общепринятым методикам [11]. В ткани печени изучен фракционный состав липидов: холестерина (ХС), фосфолипидов (ФЛ), триглицеридов (ТГ), неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol [12, с. 559–565] и содержание гликогена (ГГ) спектрофотометрическим методом по В.Г. Асатиани [12, с. 522–528]. В сыворотке крови определяли уровень аланин- и аспартатаминотрансферазы (АлАТ, АсАТ), γ-глутамилтрансферазы (ГГТ), сорбитолдегидрогеназы (СДГ), общего белка и его фракций (альбуминов, α1-, α2-, β-, γ-глобулинов), мочевины и глюкозы спектрофотометрическим методом с помощью наборов реактивов «Филисит Диагностикум» (Днепр, Украина), ХС, ТГ, липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) с помощью наборов реактивов фирмы «Ольвекс» (Россия), липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП, ЛПОНП) расчётным методом [12, с. 409].
Исследования выполнены с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986). Животных выводили из эксперимента сразу после рождения крысят с использованием высоких концентраций диоксида углерода (СО2) с последующей декапитацией. Полученные результаты статистически обработали с использованием критерия U Манна–Уитни.
Результаты и их обсуждение
При макроскопическом исследовании существенных различий ткани печени у крыс основной (2-й) и контрольной (1-й) групп не выявлено. При микроскопическом исследовании в печени крыс, получавших гиперкалорийную диету, установлены существенные отличия от печени крыс контрольной группы в виде дискомплексации балочно-радиарного строения. В центрах долек гепатоциты зачастую были в состоянии белковой дистрофии, а перипортально обнаруживались набухшие гепатоциты со светлой пенистой цитоплазмой и пикнотичными гиперхромными ядрами, что свидетельствует о нарушении их морфофункциональной активности.
Степень повреждения паренхимы печени оценивали на основании определения регенераторной активности и относительного объёма элементов паренхимы и стромы с вычислением стромально-паренхиматозного индекса.
Регенераторную активность печени оценивали на основании подсчёта количества двуядерных гепатоцитов в процентном соотношении к их одноядерным формам. Установлено, что у крыс 2-й группы количество двуядерных гепатоцитов в 1,5 раза (p<0,05) превышает их количество у животных 1-й группы: (3,44±0,03) и (2,37±0,03)% соответственно. Это свидетельствует об умеренной интенсивности повреждения печени и активации процесса регенерации паренхимы.
Результаты исследования структурных элементов печени представлены в табл. 1. Установлено, что у крыс 2-й группы имеет место достоверное уменьшение объёма паренхимы, увеличение объёма стромальной части печени и стромально-паренхиматозного индекса (р<0,05). Полученные данные свидетельствуют об активации процесса пролиферации в строме печени, что чревато развитием её фиброза в дальнейшем.
Для оценки функционального состояния печени было проведено биохимическое исследование крови и ткани печени (табл. 2 и 3).
В сыворотке крови крыс 1-й группы повышается активность органоспецифического «печёночного» фермента – СДГ (на 48,46%, p<0,05), что свидетельствует о дестабилизации мембраны гепатоцитов и «утечке» фермента из цитозоля. В то же время активность АсАТ, АлАТ изменяется умеренно, а ГГТ практически не изменяется, что может быть связано со снижением содержания или активности этих ферментов в гепатоцитах.
В сыворотке крови крыс 2-й группы содержание общего белка и альбуминов соответствует их уровню у животных 1-й группы (табл. 2), отмечается повышение α2- и β-глобулинов (на 26,08 и 19,97% соответственно), по-видимому, за счёт повышения содержания транспортных белков и ЛПОНП; выявлено уменьшение γ-глобулинов (на 10,04%). Такие показатели свидетельствуют о наличии диспротеинемии, обусловленной особенностями питания.
Содержание холестерина в сыворотке крови крыс 2-й группы соответствует таковому у крыс 1-й группы, а триглицеридов – достоверно выше (на 151,24%); соответственно в крови повышено содержание ЛПОНП на 136,37% (табл. 2). Анализ содержания липидов в гомогенате печени показал, что холестерин снижен на 27,86% (табл. 3) в связи с повышением его секреции в составе липопротеинов. Следует отметить, что в печени повышено содержание триглицеридов и НЭЖК (на 57,65 и 67,89% соответственно), табл. 3, что при повышении уровня ЛПОНП в сыворотке крови свидетельствует об активации синтеза и секреции (возможно, и депонирования) триглицеридов. Концентрация ЛПВП в крови достоверно снижена – на 41,31% (см. табл. 2), что при достаточном уровне фосфолипидов в печени (табл. 3) свидетельствует об увеличении захвата ЛПВП тканями в связи с образовавшимся избытком холестерина.
Выявленные нарушения в липидном спектре сыворотки крови можно рассматривать как риск развития сахарного диабета (СД) 2-го типа и жировой инфильтрации печени. Это подтверждается достоверным повышением содержания в сыворотке крови крыс глюкозы (на 26,58%) и кетоновых тел (на 121,89%), что свидетельствует о снижении толерантности к глюкозе и в связи с этим о повышении кетогенеза.
Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют о том, что у крыс, находившихся на высококалорийной диете в течение беременности, развивается дислипидемия (с повышением уровня ЛПНП, ЛПОНП, холестерина, триглицеридов), гипергликемия, что можно расценивать как риск развития СД 2-го типа.
В гомогенате печени крыс выявлены повышение уровня триглицеридов и НЭЖК (табл. 3), что чревато повышенным накоплением липидов печени. Это подтверждается данными исследования сыворотки крови и свидетельствует о наличии функциональных нарушений в органе на момент эксперимента, а также может стать причиной развития в будущем стеатоза, стеатогепатита и другой патологии печени.
Выводы
1.	Питание с избытком жиров и углеводов в рационе беременных самок приводит к морфофункциональным нарушениям печени, проявляющимся дискомплексацией балочно-радиарного строения, белковой дистрофией гепатоцитов, повышенной регенераторной активностью органа и повышением стромально-паренхиматозного индекса в ткани печени, которые могут стать причиной развития фиброза печени.
2.	Функциональные изменения печени проявлялись диспротеинемией, гиперлипидемией (повышение уровня холестерина, ЛПНП, триглицеридов, ЛПОНП, ЛПНП) и гипергликемией, что является фактором риска развития инсулинорезистентности, а следовательно, сахарного диабета 2-го типа.
3.	Биохимические показатели ткани печени свидетельствуют о нару-шении в ней жирового обмена в виде снижения общего холестерина, фосфолипидов и накопления триглицеридов и неэстерифицированных жирных кислот, что может привести впоследствии к жировому гепатозу и различной органической патологии печени.
Литература
1.	Дудук Н.И. Холестаз беременных и его последствия для матери и потомства / Н.И. Дудук, С.М. Зиматкин // Журнал Гродненского медицинского университета. – 2011. – № 1. – С. 3.
2.	Ибальдин А.С. Заболевания печени у беременных, принципы лечения / А.С. Ибальдин, Г.И. Шарунов, К.М. Буираев // Вестник Каз НМУ. – 2013. – № 4 (2). – С. 269.
3.	Романцова Т.И. Эпидемия ожирения: очевидные и вероятные причины / Т.Н. Романцова // Ожирение и метаболизм. – 2011. – № 1. – С. 5–19.
4.	Чабанова Н.Б. Материнское ожирение как фактор риска гестационных осложнений / Н.Б. Чабанова, Т.Н. Василькова, Г.А. Василькова // Евразийский союз ученых. – 2016. – № 30-1. – С. 84–85.
5.	Васендин Д.В. Морфологические особенности печени крыс Вистар при экспериментальном ожирении / Д.В. Васендин, С.В. Мичурина, И.Ю. Ищенко // Вестник Ивановской медицинской академии. – 2014. – Т. 19, № 4. – С. 19–22.
6.	Новгородцева Т.П. Состав липидов эритроцитов крыс при развитии фиброза печени в условиях алиментарной дислипидемии / Т.П. Новгородцева, Ю.К. Караман, Н.В. Бивалькевич // Бюллетень РАМН. – 2010. – Т. 30, № 1. – С. 53–58.
7.	Курганова И.В. Показатели липидного и белкового обмена крови и состояние клеток печени при экспериментальном ожирении: автореф. дис. … канд. мед. наук / И.В. Курганова. – Новосибирск, 2002. – 16 с.
8.	DelCurto H. Nutrition and reproduction: links to epigenetics and metabolic syndrome in offspring / H. DelCurto, G. Wu, M.C. Satterfield // Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. – 2013. – Vol. 16, № 2. – P. 385–391.
9.	Cetin I. Role of micronutrients in the periconceptional period / I. Cetin, C. Berti, S. Calabrese // Hum. Reprod Update. – 2010. –Vol. 16, № 1. – P. 80–95.
10.	 Пат. 80979 Україна МПК G09B 23/28 (2006.01) Спосіб моделювання надмірної ваги / Ніколаєва О. В., Ковальцова М. В., Євтушенко Т. Г.; заявник та патентовласник Харківський національний медичний університет . – № u 2013 01221; заявл. 01.02. 13; опубл. 10.06.13, Бюл. № 11.
11.	 Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автнадилов. – Москва: Медицина, 1990. – 384 с.
12.	 Камышников В.С. Методы клинических и лабораторных исследований / В.С. Камышников. – Москва: Медпресс-информ, 2016. – 736 с.
References
1. Duduk N.I., Zimatkin S.M. (2011). Holestaz beremennyh i iego posledstviya dlya materi i potomstva [Cholestasis of pregnant women and its consequences for mother and offspring]. Zhurnal Grodnenskogo meditsinskogo universiteta – Journal of the Grodno Medical University. 1: 3 [in Russian]. 
2. Ibaldin A.S., Sharunov G.I., Buiraev K.M. (2013). Zabolevaniya pecheni u beremennyh, principy lecheniya [Liver diseases in pregnant women, principles of treatment]. Vestnik Kaz NMU. – Bulletin of Kaz NMU. 4 (2): 269 [in Russian].
3. Romantsova T.I. (2011). Epidemiya ozhireniya: ochevidnye i veroyatnye prichiny [Epidemic of obesity: obvious and probable causes]. Ozhirenie i metabolism – Obesity and Metabolism. 1: 5–19 [in Russian].
4 Chabanova N.B., Vasilkova T.N., Vasilkova G.A. (2016). Materinskoe ozhirenie kak faktor riska gestacionnyh oslozhnenij [Maternal obesity as a risk factor for gestational complications]. Evrazijskij soyuz uchenyh – The Eurasian Union of Scientists. 30-1: 84–85 [in Russian].
5. Vasendin D.V., Michurina S.V., Ishchenko I.Yu. (2014). Morfologicheskie osobennosti pecheni krys Vistar pri ehksperimentalnom ozhirenii [Morphological features of the liver of Wistar rats with experimental obesity]. Vestnik Ivanovskoj meditsinskoi akademii – Bulletin of the Ivanovo Medical Academy. 19, 4: 19– 22 [in Russian].
6. Novgorodtseva T.P., Karaman Yu.K., Bivalkevich N.V. (2010). Sostav lipidov ehritrocitov krys pri razvitii fibroza pecheni v usloviyah alimentarnoj dislipidemii [The composition of lipids of erythrocytes in rats with the development of liver fibrosis in conditions of alimentary dyslipidemia]. Biulleten RAMN – Bulletin RAMN.  30, 1: 53–58 [in Russian].
7. Kurganova I.V. (2002). Pokazateli lipidnogo i belkovogo obmena krovi i sostoyanie kletok pecheni pri ehksperimentalnom ozhirenii [Indicators of lipid and protein metabolism of blood and liver cells in experimental obesity]: avtoref. dis. … kand. med. nauk. Novosibirsk, 16 s. [in Russian].
8. DelCurto H., Wu G., Satterfield M.C. (2013). Nutrition and reproduction: links to epigenetics and metabolic syndrome in offspring. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 16, 2: 385–391.
9. Cetin I., Berti C., Calabrese S. (2010). Role of micronutrients in the periconceptional period. Hum. Reprod. Update. 16, 1: 80–95.
10. Pat. 80979 Ukraina MPK G09B 23/28 (2006.01) Sposib modeliuvannia nadmirnoi vahy [The method of overweight modeling]/Nikolaieva O. V., Kovaltsova M. V., Yevtushenko T. H.; zaiavnyk ta patentovlasnyk Kharkivskyi natsionalnyi medychnyi universytet . № u 2013 01221; zaiavl. 01.02.13; opubl. 10.06.13, Biul. № 11 [in Russian].
11. Avtandilov G.G.(1990). Meditsinskaya morfometriya. [Medical morphometry]. Moskow: Medicina. 384 s. [in Russian].
12 Kamyshnikov V.S. (2016). Metody klinicheskih laboratornyh issledovanij. [Methods of clinical laboratory research]. Moskow: «Medipress-inform», 736 . [in Russian].

М.О. Кузнецова
ВПЛИВ гІперкалорІйного рацІонУ ХАРЧУВАННя ВАГІТНИХ ЩУРІВ НА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ПЕЧІНКИ
Досліджено морфофункціональний стан печінки 7 піддослідних щурів, що отримували впродовж вагітності незбалансоване харчування з надлишком вуглеводів і жирів, і 6 щурів групи контролю. Морфологічні зміни органа у піддослідних щурів полягали в дискомплексації балочно-радіарної будови, білковї дистрофії гепатоцитів, підвищенні регенераторної активності печінки і стромально-паренхіматозного індексу в тканині печінки. Функціональні порушення проявлялися розвитком диспротеїнемії, гіперліпідемії, гіперглікемії, гіперкетонемії. Це свідчить про наявність ризику розвитку у тварин фіброзу печінки, жирового гепатозу і ЦД 2-го типу.
Ключові слова: морфофункціональний стан печінки, гіперкалорійна дієта, вагітні щури. 

M.O. Kuznetsova
IMPACT OF THE HYPERCALORIC FOOD ON THE MORPHOLOGICAL FUNCTIONAL STATE OF THE LIVER PREGNANT RATS
The study involved examination of morphofunctional state of the liver in 7 rats receiving an unbalanced diet with an excess of carbohydrates and fats during pregnancy, and 6 rats in the control group. Morphological changes in the organ in rats of the 2nd group included discomplexation of lamino-radial structure, protein dystrophy of hepatocytes, increased regenerative activity of the liver, and enhanced conduction velocity in liver tissue. Functional disorders were manifested in the development of disproteinemia, hyperlipidemia, hyperglycemia and hyperketonemia. This indicated a risk of developing liver fibrosis, fatty hepatosis, and type 2 diabetes in the animals.
Key words: morphofunctional state of the liver, hypercaloric diet, pregnant rats.
Таблица 1. Структурные элементы печени у крыс (М±m)
Структурные элементы	Группа крыс	
	1-я (контрольная) (n=7)	2-я (основная) (n=6)	
Строма, %	28,1±1,1	29,3±1,1*	
Паренхима, %	71,9±1,1	70,7±1,1*	
Стромально-паренхиматозный индекс	0,39±0,01	0,41±0,01*	
Примечание. * р<0,05 по сравнению с 1-й группой

Таблица 2. Уровень биохимических показателей функционального состояния печени в сыворотке крови крыс (М±m)
Показатель	Группа крыс	
	1-я (контрольная) (n=7)	2-я (основная) (n=6)	
АсАТ, нмоль/с·л	27,07±0,84	25,79±0,63**	
АлАТ, нмоль/с·л	28,13±0,92	26,64±1,71*	
ГГТ, нмоль/с·л	143,65±3,67	134,14±4,13	
СДГ, нмоль/с·л	5,63±0,62	8,36±0,23*	
Общий белок, г/л	64,86±1,01	69,32±0,68**	
альбумин, %	52,48±0,75	50,75±0,64	
α1-глобулины, %	8,05±0,39	7,25±0,24	
α2-глобулины, %	8,25±0,45	10,4±0,39**	
β-глобулины, %	14,09±1,09	16,91±0,61*	
γ-глобулины, %	16,39±0,65	14,74±0,53*	
Мочевина, моль/л	7,67±0,23	3,14±0,27*	
Холестерин, ммоль/л	6,63±0,21	6,94±0,25*	
Триглицериды, ммоль/л	1,07±0,32	2,69±0,14**	
ЛПНП, ммоль/л	2,86±0,15	3,32±0,17*	
ЛПОНП, ммоль/л	0,49±0,14	1,15±0,06**	
ЛПВП, ммоль/л	3,24±0,32	1,9±0,17*	
Глюкоза, ммоль/л	6,17±0,34	7,81±0,27**	
Кетоновые тела, ммоль/л	1,85±0,35	4,11±0,29**	
Примечание. * р<0,05; ** р<0,01 – сравнение с 1-й группой.
Таблица 3. Уровень биохимических показателей функционального состояния печени в гомогенате печени крыс (М±m)
Показатель	Группа крыс	
	1-я (контрольная) (n=7)	2-я (основная) (n=6)	
Холестерин, мг/г	0,64±0,04	0,46±0,03**	
Фосфолипиды, мг/г	24,37±1,34	20,68±1,05	
Триглицериды, г/г	5,71±0,82	9±0,16**	
НЭЖК, мг/г	8,55±1,3	14,36±0,42**	
Гликоген, мг/г	26,38±1,43	26,07±2,46	
Примечание. * р<0,05; ** р<0,01 – сравнение с 1-й группой.